傳統的熒光顯微技術在生物成像領域有兩個難以克服的挑戰：一是對生物樣品的結構做3D成像。在傳統寬場熒光顯微鏡中，照明光會照亮光路上的整個樣品，來自非焦平面的雜散光信號也會被成像物鏡收集到（圖1），干擾所要觀察的樣品信號，不但降低橫向分辨率，軸向分辨率也只能達到2.5μm左右，比大多數生物結構都要大，因此很難對樣品3D結構清晰而準確地成像；另一個挑戰是對樣品內部結構清晰成像。在觀察細胞內部活動時，細胞膜的熒光信號會對成像產生極大的干擾。

圖1 小鼠腎臟切片（厚度20μm）分別在 (a) 寬場和 (b) 熒光共聚焦顯微鏡下的成像效果。哺乳動物上皮細胞（厚度50μm）分別在 (c) 寬場和 (d) 熒光共聚焦顯微鏡的成像效果。Scale bar: 20μm。(Adapted from Jonkman and Brown 2015)

如何排除這些來自非焦平面的干擾信號呢？早在1953年，美國學者馬文·明斯基就提出了“共聚焦”的構想。經過30年的發展，這一想法逐漸成為今天非常成熟的 共聚焦顯微成像技術。“共聚焦”的原理就是在樣品的共軛焦平面上添加一個帶有“針孔”的擋板（圖2），通過針孔阻斷雜散光，提高分辨率和對比度。共聚焦顯微鏡具有較好的光學切片能力，軸向分辨率可提高到500 nm左右。

圖2 共聚焦原理示意：位于共軛平面上的針孔阻擋了來自樣品上方 (a) 和下方 (b) 的雜散光，只有來自焦平面的光才能通過針孔進入探測器（c）。

傳統的激光掃描共聚焦顯微鏡使用逐點掃描，用光電倍增管（PMT）作為檢測器，雖然成像清晰，但是速度比較慢。而且PMT的光電轉換效率也比較低，需要較強的激發光。這就導致這種技術的光漂白和光損傷非常大，極不適用于活細胞成像。

為了對活細胞進行快速成像，我們本期專題的主角——轉盤式共聚焦顯微鏡閃亮登場了。

轉盤式共聚焦顯微鏡

轉盤式共聚焦顯微鏡的原理是在物鏡像平面上放置一個 Nipkow 轉盤，轉盤上分布著排列成阿基米德螺旋的針孔（圖3），激光光源覆蓋所有針孔的范圍（即掃描區域），每當轉盤旋轉30°，一個針孔就掃描圖像上對應的一塊區域，以此來實現對樣品的完整掃描。與傳統的點掃描方式相比，這種多點同步掃描方式不僅大大提高了采集速度，也意味著可以使用面陣相機（背照式sCMOS或EMCCD）取代PMT，提高量子效率，從而降低激發光功率，大大降低了對樣品的光漂白和光損傷。轉盤共聚焦模塊通常是獨立的，可以加在顯微鏡的相機端口（圖4）。圖像亮度、對比度和光學切片質量都可以通過優化轉盤性能得到改善。

圖4 Yokogawa CSU-X1轉盤共聚焦裝置示意。該裝置包括電動旋轉針孔盤和微透鏡盤，可安裝在顯微鏡的攝像機端口上。（From Zeiss Campus）

與激光掃描共聚焦相比，轉盤式共聚焦具有高速，高靈敏度，易于安裝等優點，更適合研究活細胞及其內部動態過程。

透射率

入射光通過轉盤的比率稱為透射率T，可用如下公式計算:

D：針孔直徑；S：針孔間隔距離。
針孔直徑決定了穿過針孔的光的多少——較大的針孔可以讓更多的光通過；而間隔距離決定了較長尺度上的阻斷雜散光的能力。離焦平面足夠遠的雜散光會進入相鄰的針孔，這一過程稱為針孔串擾（Pinhole cross-talk）。串擾的程度取決于樣品，樣品越厚影響越大。增加間隔距離可以降低串擾，但代價是減少光的通過率。

當我們帶入典型值D=25μm和S=250μm，可以得到透射率僅為1%，說明絕大多數光（主要是雜散光）都可以被阻擋。然而，激發光強和相機靈敏度仍然是決定圖像質量的關鍵。

轉盤照明光的透射率可以通過微透鏡進行提高。圖5為 Yokogawa 公司設計的轉盤裝置，它由兩個同軸排列的圓盤組成，每個圓盤包含大約20000個針孔。上圓盤在下圓盤每一個針孔對應的位置都裝有微透鏡，將入射光直接聚焦在下圓盤的針孔上，再照射到樣品上。通過添加微透鏡盤，可以將透射率提高一個數量級（Inoue and Inoue 2002），進一步降低了激發光強度。

圖5：微透鏡圓盤通過主圓盤的針孔聚焦照明光。發射光被分色鏡分離進入相機（Graf, Rietdorf and Zimmermann 2005）。

針孔直徑

針孔直徑是轉盤式共聚焦系統的一個重要參數。針孔過大會降低軸向分辨率。針孔過小又會導致照明光過度衍射和過度阻擋發射光，降低圖像對比度。通常來說，轉盤針孔直徑都會由制造商針對60倍或100倍油鏡進行優化。

對于給定物鏡的系統來說，有三個關鍵參數決定了*佳針孔直徑（Dopt）：

1. 發射光波長λEm

2. 物鏡數值孔徑NAopt

3. 物鏡放大倍數Mopt
   

有如下公式：

以GFP為例（λEm=509nm），使用1.4NA，60x油鏡，*佳針孔直徑為26.2μm。對于1.4NA，100x油鏡，*佳直徑為43.6μm。

分辨率

與常規熒光顯微鏡一樣，轉盤共聚焦顯微鏡的橫向分辨率由光學系統決定，不過成像對比度增加，因此對樣品細節的分辨能力更好。在選擇相機時，需要考慮像元尺寸和系統光學分辨率之間的匹配。（不會選擇？快快點擊閱讀分辨率中——作成像的你不得不了解的真相6）

轉盤共聚焦顯微鏡的軸向分辨率通常在800nm左右（使用高NA 物鏡）。根據奈奎斯特采樣定律，z軸步進約為350nm左右。如果需要獲得更清晰，對比度更好的圖像，就需要進行反卷積，我們將在后續文章中詳細為大家介紹。

針孔聚焦

使用轉盤共聚焦顯微鏡需要一個額外的步驟：由于圖像是在Nipkow-Petran轉盤的平面上形成的，因此需要將相機聚焦到該平面上以采集圖像。當相機未聚焦時，圖像就會模糊（圖6）。幸運的是，這些針孔為正確的焦平面提供了參考。要將相機聚焦在針孔平面上，首先必須停止轉盤旋轉，然后將調節相機距離直到針孔邊緣清晰，就可以得到清晰的圖像了。

圖6 相機未聚焦導致的圖像模糊。（1.49NA，100x物鏡）（Stehbens, et al. 2012）

采集速度

從原理上來說，轉盤共聚焦顯微鏡的*大采集速度取決于至少一個針孔掃描整個圖像的速度——通常是圓盤旋轉30°所需的時間。在曝光時間很短的應用中（如高速動態成像），如果曝光時間小于掃描時間，則部分樣品不會被掃描到，就會出現黑線（圖7，左）。轉盤旋轉速度較慢也會導致不完全掃描，圖像也會出現條紋（圖7，中）。解決這個問題的方法是使相機的曝光與轉盤的旋轉同步，確保曝光時間等于掃描時間的整數倍。當曝光時間使用比掃描時間長得多時，就可以避免這個問題（圖7，右）

圖7 在較短的曝光時間或較低的轉盤旋轉速度下，相機曝光和轉盤旋轉不同步導致樣本覆蓋不均，成像時出現條紋。（1.49NA，100x物鏡）Scale bar: 10μm. (Stehbens, et al. 2012)

然而，在實際的顯微成像設置中，由于發射的熒光穿透轉盤的透過率很低，為了獲得較好的信噪比，曝光時間一般不會很短，所以系統的*終成像速度其實是受限于相機的曝光時間。對于速度較慢的CCD相機來說，主要是受限于相機自身的讀出幀速。

轉盤式共聚焦顯微鏡克服了傳統熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦的缺點，廣泛應用于活細胞3D成像，快速動態成像，長時間時間序列拍攝以及內部細節結構成像等應用。然而，由于它是通過抑制光通過來提高分辨率的，搭建系統時，要確保相機能盡可能多地收集光子。因此，在相機選擇上，高靈敏度是首要標準。EMCCD相機曾經是轉盤共聚焦顯微系統的**選擇，但現在，越來越多的用戶正轉向背照式sCMOS相機（如Prime 95B，Prime BSI），它們具有與EMCCD相機相當的靈敏度，但視野更大，成像速度更快。

在下一期中，我們將繼續介紹一些不同的轉盤式共聚焦顯微系統及其應用，請大家繼續關注我們的前沿顯微成像技術專題系列哦~

References

Graf, R, J Rietdorf, and T Zimmermann. 2005. “Live Cell Spinning Disk Microscopy.” Adv Biochem Engin/Biotechnol 95: 57-75.

Inoue, S, and T Inoue. 2002. “Direct-View High-Speed Confocal Scanner: The CSU-10.” Methods Cell Biology 70.

Jonkman, J, and C M Brown. 2015. “Any Way You Slice It - A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.” Journal of Biomolecular Techniques 26: 54-65.

Stehbens, S, H Pemble, L Murrow, and T Wittmann. 2012. “Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.” Nature Methods Enzymology 504: 293-313.